МИКРОБИОТА ПОЛОСТИ РТА ПРИ ГАЛИТОЗЕ И ВОЗМОЖНОСТЬ ЕЕ КОРРЕКЦИИ С ПОМОЩЬЮ АНТИМИКРОБНЫХ ОПОЛАСКИВАТЕЛЕЙ

Резюме

Актуальность. Современные данные указывают на полимикробную этиологию галитоза, что в значительной степени затрудняет эффективную терапию. В этой связи комплексное изучение этиологических факторов у пациентов с галитозом, основанное на микробиологическом исследовании состава смешанных микробных биопленок, включающих культивируемые и плохо культивируемые микробы, и оценка эффективности использования для лечения ополаскивателей с антимикробными препаратами широкого спектра действия является актуальным.

Цель. Изучение микробиоты полости рта при галитозе и ее коррекции с помощью антибактериальных ополаскивателей.

Материалы и методы. Участники исследования были разделены на три группы по 20 человек: контрольная группа – ополаскиватели не использовались; экспериментальная группа – использовался ополаскиватель, содержащий мультицид; группа сравнения – использовался ополаскиватель содержащий хлоргексидин. Интенсивность галитоза определялась органолептическим методом с оценкой по 5-балльной шкале Розенберга. Проводились микробиологические исследования налета с корня языка с использованием культурального метода.

Результаты. Проведенные исследования показали, что использование ополаскивателя на основе Multicidum® в комплексном лечении галитоза влияет на аэробные бактерии микробиоты, вовлеченные в патологический процесс, сопровождающийся появлением неприятного запаха изо рта. Положительный эффект проявлялся снижением запаха, определяемого органолептическим методом по шкале Розенберга, а также изменением состава микробиоты на корне языка. При этом зарегистрировано снижение количества микроорганизмов, участвующих в образовании пахучих летучих соединений, и увеличение количества бактерий, угнетающих этот процесс, на фоне снижения спорообразующих бактерий, способствующих поддержанию устойчивых микробных сообществ при галитозе.

Заключение. Среди идентифицированных у пациентов с галитозом бактерий преобладали грамположительные кокки и палочки – Streptococcus, Enterobacter, Staphylococcus, Granulicatella adiacens, Rothia и аэробные спорообразующие бактерии – представители семейства Bacillus, участвующие в поддержании функций устойчивых бактериальных сообществ. Установлено статистически значимое снижение выраженности галитоза под действием ополаскивателя, основным действующим веществом которого является Multicidum®, и отсутствие статистически значимого эффекта при использовании ополаскивателя на основе хлоргексидина.

Ключевые слова: микробиота, споробиота, галитоз, антимикробные ополаскиватели, лечение.

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Распространенность галитоза, по данным метаанализа популяционных исследований, составляет 31,8%, при этом отмечается тенденция к ее увеличению [1]. Хотя этиология галитоза является многофакторной, примерно 90% источников неприятного запаха имеют внутриротовое про исхождение и связаны с патологическими состояниями полости рта и физиологическими особенностями, в частности микробным обсеменением языка [2, 3]. Таким об разом, стоматологи являются профессионалами первой линии, которые сталкиваются с проблемой галитоза.

Налет на языке содержит широкий спектр бактерий, ко торые производят различные метаболиты, включающие летучие соединения серы, такие как сероводород, метил меркаптан и диметилсульфид, – их продукция является основной причиной внутриротового галитоза [46].

В настоящее время возможности технологии секвенирования следующего поколения (NGS) [7] позволяют анализировать микробные сообщества, связанные с галитозом, включая ранее некультурные микроорганизмы [8], обеспечивая более глубокое понимание микроэкологических изменений. Установлено, что у пациентов с галитозом имеют место пероральные особенности в микробиомах [912]. Так, Leptotrichia и Prevotella положительно коррелировали с выраженностью неприятного запаха изо рта, в то время как у Hemophilus и Gemella обнаруживалась отрицательная связь с выраженностью галитоза [10]. Wei Yeetal. (2019), используя методы пиросеквенирования и метагеномики гена 16S рРНК, выявили в полости рта широкий круг микробных сообществ, в том числе 13 типов, 23 класса, 37 отрядов, 134 рода, 266 видов и 349 действующих таксономических единиц. Относительная распространенность 11 таксонов, включая Prevotella, Alloprevotella, Leptotrichia, Peptostreptococcus и Stomatobaculum, была значительно выше у пациентов с галитозом (p < 0,05), на фоне более низ кой распространенности четырех таксонов, включая Co mamonas и Bergeyella [11]. с использованием комбинации методов культивирования и культурно независимого клонирования, в биопленке с языка у пациентов с галитозом было выделено более 80 различных видов бактерий, при этом установлена выраженная связь Actinomyces graevenit zii, S. mitis / oralis, S. pseudopneumoniae и S. infantis, а также видов Prevotella с галитозом [13].

Таким образом, в большинстве работ установлено боль шее видовое разнообразие микрофлоры в полости рта у пациентов при галитозе [11,13]. Однако в ряде работ связи галитоза с увеличением видового разнообразия микрофлоры в полости рта не установлено [10, 4], что подтверждает необходимость проведения дальнейших исследований.

Особенности локализации патологического процесса и разнообразие микробов, вызывающих галитоз, предъявляют особые требования к препаратам, используемым в терапии. Наиболее часто применяются полоскания и зубные пасты, включающие хлоргексидин, хлордиоксид, триклозан, перекись водорода [14], эфирные масла, фторид олова цинк [1517]. Однако местное комплексное лечение галитоза, даже при четком соблюдении рекомендаций врача, дает положительный эффект лишь в 82% случаев [18].

Полимикробная этиология галитоза [9, 4, 11, 13] в значительной степени затрудняет эффективную терапию, а проблема распространения условно патогенных и патогенных бактерий при галитозе в условиях применяемой терапии изучена недостаточно. В этой связи комплексное изучение этиологических факторов у пациентов с внутри ротовым галитозом и сравнительная оценка эффективно сти использования для лечения ополаскивателей с анти микробными препаратами широкого спектра действия являются актуальными и имеют практический интерес.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение микробиоты полости рта при галитозе и ее коррекции с помощью антибактериальных ополаскивателей.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1) провести микробиологическое исследование со става смешанных микробных биопленок, включающих культивируемые и плохо культивируемые микробы в полости рта у пациентов с галитозом;
2) провести сравнительную оценку эффективности при галитозе ополаскивателей полости рта на основе мультицида и хлоргексидина.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводились на кафедре пропедевтики стоматологических заболеваний, кафедре микро биологии и вирусологии, НИИ стоматологии и ЧЛХ ГБОУ ВО ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.

По результатам органолептического обследования была отобрана группа пациентов с интенсивностью галитоза 2 и более баллов по шкале Розенберга. Далее в соответствии с критериями отбора была сформирована группа пациентов, включающая 60 человек. Критерии включения: пациенты обоего пола в возрасте 2040 лет, отсутствие заболеваний пародонта. Критерии невключения: возраст младше 20 и старше 40 лет, заболевания пародонта, отягощенный аллергологический анамнез; алкогольная, наркотическая, токсическая зависимость. Все процедуры были выполнены в соответствии с принципа ми Хельсинкской декларации, письменное согласие было получено от всех включенных в исследование пациентов. Участники исследования были разделены на три группы:

• 1я группа (контрольная) – 20 человек (14 женщин, 6 мужчин), средний возраст 34,7 ± 1,1 лет, оценка галитоза по шкале Розенберга 3,25 ± 0,17 балла. Продолжа ли проводить привычную гигиену полости рта.
• 2я группа (экспериментальная) – 20 человек (16 женщин, 4 мужчин), средний возраст 33,0 ± 0,8 лет, оценка галитоза по шкале Розенберга 3,5 ± 0,2 балла. Пользовались ополаскивателем для полости рта, основным действующим веществом которого является российский препарат Multicidum® (20 мл в течение 1 минуты, два раза в день). 
• 3 группа (сравнения) – 20 человек (14 женщин 6 муж чин), средний возраст 31,4 ± 1,0 лет, оценка галитоза по шкале Розенберга 3,1 ± 0,2 балла. Пользовались ополаскивателем для полости рта, основным действующим веществом которого является Chlorhexidine Digluconate 0,05% (20 мл в течение 1 минуты, два раза в день).

Интенсивность галитоза определялась органолептическим методом с оценкой по 5-балльной шкале Розенберга два раза – до начала исследования и после его завершения. Забор материала с корня языка для микробиологического исследования проводился два раза: перед началом эксперимента и после его завершения (через один месяц). Время между забором ма териала и включением его в исследование не превышало 6 часов с хранением при +4 ºс.

Мазки окрашивали по Граму. Для культивирования использовались питательные среды: Мюллера Хинтона, Колумбийский агар и бульон (Oxoid, Великобритания). Определение биохимической активности микроорганизмов проводили с помощью системы Vitek 2 (bioMerieux, Франция). Идентификацию бактерий по протеому клетки выполняли при помощи масс спектрометрии MALDITOF/TOF с пробоподготовкой на микротитрационных планшетах AnchorChip (Bruker Corporation, США) с идентификацией относительно MALDI Biotyper Database (Bruker Taxonomy Tree) (Bruker Corpo ration, США). секвенирование гена 16S рРНК проводи ли с помощью набора BigDye TM Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystem, сША) и автоматического секвенатора ABI Prism Genetic Analyzer 3730XL (Applied Biosystems, сША), а также программного пакета Sequencing Analysis 5.3.1 (Applied Biosystems, США). Секвенирование генома выполнено с помощью HiSeq 2500 платформы (GAIIx, Illumina, США) согласно инструкции производителя. Геном был собран с использованием программы SPAdes 3.5.0, аннотированная с использованием NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline. ДНК-ДНК гибридизация выполнена методом компьютерного анализа.

Материалы исследования обрабатывались с использо ванием пакета статистических программ StatSoft Statistica 10.0.1011.0 Russian Portable для Windows10 и Microsoft Exel 2017. Достоверность различий между относительными величинами рассчитывали по формуле [19]: 

 

 где  Р1 и Р2 – сравниваемые относительные величины; N1 и N2 – количество наблюдений в 1й и 2й выборке.

Результаты, выраженные в баллах, сравнивали с по мощью U-критерия Манна – Уитни с использованием онлайн калькулятора медицинской статистики (http:// medstatistic.ru/calculators/calcmann.html).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

По данным микробиологического исследования с использованием культурального (бактериологического) метода с корня языка пациентов изолировано значительное количество аэробных бактерий (от 9 до 25 различных штаммов от одного пациента), большая часть которых после идентификации методами био химического, протеомного и генетического анализов оказались бактериями, ранее не описанными в составе микробиоты при галитозе. Среди идентифицированных бактерий преобладали грамположительные кокки и палочки:

1) Streptococcus (100% обследованных);
2) Enterobacter (80% обследованных);
3) Staphylococcus (72% обследованных);
4) Granulicatella adiacens (60% обследованных);
5) Rothia (53% обследованных) (табл. 1).

Особую группу выделенных бактерий составляли представители семейства Bacillus, высеянные у 45% обследованных (табл. 1). Ранее аэробные спорообраующие бактерии не были описаны в составе микро биоты при галитозе. Наличие у значительного числа обследованных спорообразующих бактерий в составе микробиоты указывает на их участие в поддержании функций этих устойчивых бактериальных сообществ. Споробиом содержит много различных генов патогенности и антибиотикоустойчивости, которые длительно сохраняются в спорах и в дальнейшем распространяются между родственными и неродственными бактериями в биопленках. Особенности действия антисеп тиков/дезинфектантов и антибиотиков на споробиоту требуют пересмотра методов профилактики и лечения. Поскольку в состоянии спор эти бактерии не чувствительны к большинству противомикробных препаратов, для эффективной борьбы с ними необходим подбор средств, способных их инактивировать.



Анализ результатов исследования в экспериментальной группе и группе сравнения показал снижение в обе их группах микроорганизмов, участвующих в образовании пахучих летучих соединений (Streptococcus, Rothiamucilaginosa, Enterobacter, Granulicatella adiacens), наиболее выраженное в экспериментальной группе. Необходимо отметить статистически значимое увеличение в контрольной группе количества бактерий, угнетающих этот процесс (Lactobacillus) (табл. 1). существенное значение имеет тот факт, что у пациентов экспериментальной группы отмечается статистически значимое снижение встречаемости аэробных спорообразующих бактерий в составе микробиоты, что согласуется с за явленными производителем данными о бактерицидном действии препарата Multicidum® (наномолекула препарата размером 1,52 нм проникает в микробные био пленки и разрушает ее, обладает широким спектром действия, в том числе на споры бактерий и грибов).

Для оценки действия препарата Multicidum® на от дельные штаммы нами была исследована его минимальная подавляющая концентрация (МПК). Показатели МПК для всех изучаемых штаммов находились в диапазоне от 0,035 до 5,0 мкг/мл. Полученные данные подтверждают зарегистрированную эффективность препарата, который используется в ополаскивателе в концентрации 50 мкг/мл.

Эффективность использования ополаскивателя на основе Multicidum® при галитозе подтверждена результатами органолептического исследования. В экспериментальной группе снижение выраженности галитоза составило 73% (с 3,50 до 0,95 баллов). U-критерий Манна – Уитни равен 12,5. Критическое значение U-критерия Манна – Уитни при заданной численности сравниваемых групп составляет 127, при этом 12,5 ≤ 127, различия статистически значимы (р < 0,05). В группе сравнения снижение выраженности галитоза произошло в среднем на 43% (с 3,40 до 1,95 баллов). U-критерий Манна – Уитни равен 76,5. Критическое значение U-критерия Манна – Уитни при заданной численности сравниваемых групп составляет 127, при этом 76,5 ≤ 127, различия статистически значимы (р < 0,05). В контрольной группе снижение выраженности галитоза произошло в среднем на 12,5% (с 3,25 до 2,95 баллов). U-критерий Манна – Уитни равен 169,5 Критическое значение U-критерия Манна – Уитни при заданной численности сравниваемых групп составляет 127, при этом 169,5 > 127, различия статистически не значимы (р > 0,05).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что использование ополаскивателя на основе Multicidum® в комплексном лечении галитоза влияет на аэробные бактерии микробиоты, вовлеченные в патологический  процесс, сопровождающийся появлением неприятного запаха изо рта. Положительный результат проявлялся снижением запаха, определяемого органолептическим методом по шкале Розенберга, а также изменением со става микробиоты на корне языка. Зарегистрировано снижение количества микроорганизмов, участвующих в образовании пахучих летучих соединений, и спорообразующих бактерий, способствующих поддержанию устойчивых микробных сообществ. На этом фоне отмечается увеличение количества бактерий, угнетающих образование пахучих летучих соединений.

ВЫВОДЫ

1) Микробиологическое исследование состава смешанных микробных биопленок выявило на корне языка у пациентов с галитозом, в основном грамположительные кокки и палочки: Streptococcus, Enterobacter, Staphylococcus; Granulicatella adiacens, Rothia.
2) У 45% пациентов с галитозом выделены аэробные спорообразующие бактерии представители семейства Bacillus, участвующие в поддержании функций устойчивых бактериальных сообществ.
3) сравнительная оценка клинической эффективности при галитозе ополаскивателей полости рта показала статистически значимое снижение выраженности галитоза под действием ополаскивателя, основным действующим веществом которого является Multicidum® и отсутствие статистически значимого эффекта при использовании ополаскивателя на основе хлоргексидина.
4) Клиническая эффективность ополаскивателя, содержащего Multicidum®, обусловлена выраженным снижением в составе микробиоты микроорганизмов, участвующих в образовании пахучих летучих соединений, и уменьшением аэробных спорообразующих бактерий, что связано с его широким спектром действия, в том числе на споры бактерий и грибов.

Список литературы

1. M. F. Silva, F. R. M. Leite, L. B. Ferreira, N. M. Pola, F. A. Scannapieco, F. F. Demarco, G. G. Nascimento. Estimated prevalence of halitosis: a sys tematic review and metaregression analysis. Clinical Oral Investigations. 2018;22(1):4755. https://doi.org/10.1007/s0078401721645.
2. A. B. Damla. A current approach to halitosis and oral malodor – A mini review. Open Dent J. 2018;12:322330. https://doi.org/10.2174/1874210601812010322.
3. K. Seerangaiyan, F. Juch, E. G. Winkel. Tongue coating: its characteris tics and role in intraoral halitosis and general healtha review. J. Breath Res. 2018;12(3):034001. https://doi.org/10.1088/17527163/aaa3a1.
4. K. Seerangaiyan, A. J. van Winkelhoff, H. J. M. Harmsen, J. W. A. Ros sen, E. G. Winkel. The tongue microbiome in healthy subjects and patients with intra oral halitosis. Journal of Breath Research. 2017;11(3):036010. https://doi.org/10.1088/17527163/aa7c24.
5. H. S. Shon, K. O. Kim, J. K. Jung, E. J. Cha, S. O. Lee, K. A. Kim. Intra Oral Factors Influencing Halitosis in Young Women. Osong Public Health Res Perspect. 2018;9(6):340347. https://doi.org/10.24171/j.phrp.2018.9.6.08.
6. S. Bernardi, M. A. Continenza, A. Al Ahmad, L. Karygianni, M. Follo, A. Filippi, G. Macchiarelli. Streptococcus spp. and Fusobacterium nuclea tum in tongue dorsum biofilm from halitosis patients: A fluorescence in situ hybridization (FISH) and confocal laser scanning microscopy (CLSM) study. The New Microbiologica. 2019;42(2):108113.
7. K. Faust, J.Fah Sathirapongsasuti, J. Izard, N. Segata, D. Gevers, J. Raes, C. Huttenhower. Microbial cooccurrence relationships in the human microbiome PLoS Comput. Biol. 2012(12). https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1002606.
8. J. F. Siqueira, I. N. Rôças, M. S. Paiva, K. M. Magalhães. Cultivable bacteria in infected root canals as identifed by 16S rRNA gene sequencing. Oral Microbiol. Immunol. 2007;22(4):266271. https://doi.org/10.1111/j.1399302X.2007.00355.x.
9. Примак Т.Д. Микробные ассоциации при галитозе у взрослых. Инфекция и иммунитет. 2017:958. [T. D. Primak. Mikrobnye associacii pri galitoze u vzroslyh. Infekciya i immunitet. 2017:958. (In Russ.)].
10. F. Yang, S. Huang, T. He, C. Catrenich, F. Teng, C. Bo, J. Chen, J. Liu, J. Li, Y. Song, R. Li, J. Xu. Microbial basis of oral malodor development in humans. J. Dent. Res. 2013;92:11061112. https://doi.org/10.1177/0022034513507065.
11. Ye Wei, Zhang Yu, He Mei, Zhu Ce, Feng XiPing. Relationship of tongue coating microbiome on volatile sulfur compounds in healthy and halitosis adults. Journal of Breath Research. 2019;14(1):016005. https://doi. org/10.1088/17527163/ab47b4.
12. W. Ren, Z. Xun, Z. Wang, Q. Zhang, X. Liu, H. Zheng, Q. Zhang, Y. Zhang, L. Zhang, C. Wu, S. Zheng, N. Qin, S. D. Ehrlich, Y. Li, X. He, T. Xu, T. Chen, F. Chen. Tongue coating and the salivary microbial communities vary in children with halitosis. Sci Rep. 2016;6:24481. https://doi.org/10.1038/srep24481.
13. S. Bernardi, L. Karygianni, A. Filippi, A. C. Anderson, A. Zürcher, E. Hellwig, K. Vach, G. Macchiarelli, A. AlAhmad. Combining culture and culture independent methods reveals new microbial composition of hali tosis patients’ tongue biofilm. Microbiologyopen. 2019;14:958. https://doi. org/10.1002/mbo3.958.
14. Sharma Kriti, Acharya Shashidhar, Verma Eshan, Singhal Deepak, Singla Nishu. Efcacy of chlorhexidine, hydrogen peroxide and tulsi extract mouthwash in reducing halitosis using spectrophotometric analysis: A randomized controlled trial. J Clin Exp Dent. 2019;11(5):457463. http://dx.doi.org/10.4317/jced.55523.
15. Улитовский с. Б., Калинина О. В., Панкратьева Л. И. Оценка эф фективности применения зубной пасты на основе эфирного масла ке дра в профилактике истинного патологического орального галитоза. Ученые записки сПбГМУ им. И.П. Павлова. 2017;XXIV(4):6467. [S. B. Uli tovskij, O. V. Kalinina, L. I. Pankrat’eva. Ocenka effektivnosti primeneniya zubnoj pasty na osnove efirnogo masla kedra v profilaktike istinnogo pato logicheskogo oral’nogo galitoza. Uchenye zapiski SPbGMU im. I.P. Pavlova. 2017;XXIV(4):6467. (In Russ.)]. https://elibrary.ru/item.asp?id=32469020.
16. S. Saad, M. Fitzgerald, K. Hewett, J. Greenman, M. Vandeven, H. M. Trivedi, J. G. Masters. Shortand LongTerm Effects of a Dentifrice Containing Dual Zinc plus Arginine on IntraOral Halitosis: Improvements in Breath Quality. Journal of Clinical Dentistry. 2018;29(3):4654. https://www. ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30620871.
17. A. Johannsen, C. G. Emilson, G. Johannsen, K. Konradsson, P. Ling ström, P. Ramberg. Effects of stabilized stannous fuoride dentifrice on dental calculus, dental plaque, gingivitis, halitosis and stain: A systematic review. Heliyon. 2019;5(12):02850. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2019.e02850.
18. Фирсова И. В., Федотова Ю. М., Михальченко В. Ф., Димитрова М. с., Веремеенко Т. В., Бакланова А. А. Комплексный подход устранения гали тоза. Международный журнал прикладных и фундаментальных иссле дований. 2016;3:100102. [I. V. Firsova, Yu. M. Fedotova, V. F. Mihal’chenko, M. S. Dimitrova, T. V. Veremeenko, A. A. Baklanova. Kompleksnyj podhod us traneniya galitoza. Mezhdunarodnyj zhurnal prikladnyh i fundamental’nyh issle dovanij. 2016;3:100102. (In Russ.)]. https://elibrary.ru/item.asp?id=25590962.
19. Каминский Л. с. статистическая обработка лабораторных и кли нических данных. Применение статистики в научной и практической работе врача. 1964. [L. S. Kaminskij. Statisticheskaya obrabotka labora tornyh i klinicheskih dannyh. Primenenie statistiki v nauchnoj i prakticheskoj rabote vracha. 1964. (In Russ.)].